傳統(tǒng)的熒光顯微技術在生物成像領域有兩個難以克服的挑戰(zhàn)：一是對生物樣品的結構做3D成像。在傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡中，照明光會照亮光路上的整個樣品，來自非焦平面的雜散光信號也會被成像物鏡收集到（圖1），干擾所要觀察的樣品信號，不但降低橫向分辨率，軸向分辨率也只能達到2.5μm左右，比大多數(shù)生物結構都要大，因此很難對樣品3D結構清晰而準確地成像；另一個挑戰(zhàn)是對樣品內(nèi)部結構清晰成像。在觀察細胞內(nèi)部活動時，細胞膜的熒光信號會對成像產(chǎn)生極大的干擾。

圖1 小鼠腎臟切片（厚度20μm）分別在 (a) 寬場和 (b) 熒光共聚焦顯微鏡下的成像效果。哺乳動物上皮細胞（厚度50μm）分別在 (c) 寬場和 (d) 熒光共聚焦顯微鏡的成像效果。Scale bar: 20μm。(Adapted from Jonkman and Brown 2015)

如何排除這些來自非焦平面的干擾信號呢？早在1953年，美國學者馬文·明斯基就提出了“共聚焦”的構想。經(jīng)過30年的發(fā)展，這一想法逐漸成為今天非常成熟的 共聚焦顯微成像技術。“共聚焦”的原理就是在樣品的共軛焦平面上添加一個帶有“針孔”的擋板（圖2），通過針孔阻斷雜散光，提高分辨率和對比度。共聚焦顯微鏡具有較好的光學切片能力，軸向分辨率可提高到500 nm左右。

圖2 共聚焦原理示意：位于共軛平面上的針孔阻擋了來自樣品上方 (a) 和下方 (b) 的雜散光，只有來自焦平面的光才能通過針孔進入探測器（c）。

傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微鏡使用逐點掃描，用光電倍增管（PMT）作為檢測器，雖然成像清晰，但是速度比較慢。而且PMT的光電轉換效率也比較低，需要較強的激發(fā)光。這就導致這種技術的光漂白和光損傷非常大，極不適用于活細胞成像。

為了對活細胞進行快速成像，我們本期專題的主角——轉盤式共聚焦顯微鏡閃亮登場了。

轉盤式共聚焦顯微鏡

轉盤式共聚焦顯微鏡的原理是在物鏡像平面上放置一個 Nipkow 轉盤，轉盤上分布著排列成阿基米德螺旋的針孔（圖3），激光光源覆蓋所有針孔的范圍（即掃描區(qū)域），每當轉盤旋轉30°，一個針孔就掃描圖像上對應的一塊區(qū)域，以此來實現(xiàn)對樣品的完整掃描。與傳統(tǒng)的點掃描方式相比，這種多點同步掃描方式不僅大大提高了采集速度，也意味著可以使用面陣相機（背照式sCMOS或EMCCD）取代PMT，提高量子效率，從而降低激發(fā)光功率，大大降低了對樣品的光漂白和光損傷。轉盤共聚焦模塊通常是獨立的，可以加在顯微鏡的相機端口（圖4）。圖像亮度、對比度和光學切片質量都可以通過優(yōu)化轉盤性能得到改善。

圖4 Yokogawa CSU-X1轉盤共聚焦裝置示意。該裝置包括電動旋轉針孔盤和微透鏡盤，可安裝在顯微鏡的攝像機端口上。（From Zeiss Campus）

與激光掃描共聚焦相比，轉盤式共聚焦具有高速，高靈敏度，易于安裝等優(yōu)點，更適合研究活細胞及其內(nèi)部動態(tài)過程。

透射率

入射光通過轉盤的比率稱為透射率T，可用如下公式計算:

D：針孔直徑；S：針孔間隔距離。
針孔直徑?jīng)Q定了穿過針孔的光的多少——較大的針孔可以讓更多的光通過；而間隔距離決定了較長尺度上的阻斷雜散光的能力。離焦平面足夠遠的雜散光會進入相鄰的針孔，這一過程稱為針孔串擾（Pinhole cross-talk）。串擾的程度取決于樣品，樣品越厚影響越大。增加間隔距離可以降低串擾，但代價是減少光的通過率。

當我們帶入典型值D=25μm和S=250μm，可以得到透射率僅為1%，說明絕大多數(shù)光（主要是雜散光）都可以被阻擋。然而，激發(fā)光強和相機靈敏度仍然是決定圖像質量的關鍵。

轉盤照明光的透射率可以通過微透鏡進行提高。圖5為 Yokogawa 公司設計的轉盤裝置，它由兩個同軸排列的圓盤組成，每個圓盤包含大約20000個針孔。上圓盤在下圓盤每一個針孔對應的位置都裝有微透鏡，將入射光直接聚焦在下圓盤的針孔上，再照射到樣品上。通過添加微透鏡盤，可以將透射率提高一個數(shù)量級（Inoue and Inoue 2002），進一步降低了激發(fā)光強度。

圖5：微透鏡圓盤通過主圓盤的針孔聚焦照明光。發(fā)射光被分色鏡分離進入相機（Graf, Rietdorf and Zimmermann 2005）。

針孔直徑

針孔直徑是轉盤式共聚焦系統(tǒng)的一個重要參數(shù)。針孔過大會降低軸向分辨率。針孔過小又會導致照明光過度衍射和過度阻擋發(fā)射光，降低圖像對比度。通常來說，轉盤針孔直徑都會由制造商針對60倍或100倍油鏡進行優(yōu)化。

對于給定物鏡的系統(tǒng)來說，有三個關鍵參數(shù)決定了*佳針孔直徑（Dopt）：

1. 發(fā)射光波長λEm

2. 物鏡數(shù)值孔徑NAopt

3. 物鏡放大倍數(shù)Mopt
   

有如下公式：

以GFP為例（λEm=509nm），使用1.4NA，60x油鏡，*佳針孔直徑為26.2μm。對于1.4NA，100x油鏡，*佳直徑為43.6μm。

分辨率

與常規(guī)熒光顯微鏡一樣，轉盤共聚焦顯微鏡的橫向分辨率由光學系統(tǒng)決定，不過成像對比度增加，因此對樣品細節(jié)的分辨能力更好。在選擇相機時，需要考慮像元尺寸和系統(tǒng)光學分辨率之間的匹配。（不會選擇？快快點擊閱讀分辨率中——作成像的你不得不了解的真相6）

轉盤共聚焦顯微鏡的軸向分辨率通常在800nm左右（使用高NA 物鏡）。根據(jù)奈奎斯特采樣定律，z軸步進約為350nm左右。如果需要獲得更清晰，對比度更好的圖像，就需要進行反卷積，我們將在后續(xù)文章中詳細為大家介紹。

針孔聚焦

使用轉盤共聚焦顯微鏡需要一個額外的步驟：由于圖像是在Nipkow-Petran轉盤的平面上形成的，因此需要將相機聚焦到該平面上以采集圖像。當相機未聚焦時，圖像就會模糊（圖6）。幸運的是，這些針孔為正確的焦平面提供了參考。要將相機聚焦在針孔平面上，首先必須停止轉盤旋轉，然后將調節(jié)相機距離直到針孔邊緣清晰，就可以得到清晰的圖像了。

圖6 相機未聚焦導致的圖像模糊。（1.49NA，100x物鏡）（Stehbens, et al. 2012）

采集速度

從原理上來說，轉盤共聚焦顯微鏡的*大采集速度取決于至少一個針孔掃描整個圖像的速度——通常是圓盤旋轉30°所需的時間。在曝光時間很短的應用中（如高速動態(tài)成像），如果曝光時間小于掃描時間，則部分樣品不會被掃描到，就會出現(xiàn)黑線（圖7，左）。轉盤旋轉速度較慢也會導致不完全掃描，圖像也會出現(xiàn)條紋（圖7，中）。解決這個問題的方法是使相機的曝光與轉盤的旋轉同步，確保曝光時間等于掃描時間的整數(shù)倍。當曝光時間使用比掃描時間長得多時，就可以避免這個問題（圖7，右）

圖7 在較短的曝光時間或較低的轉盤旋轉速度下，相機曝光和轉盤旋轉不同步導致樣本覆蓋不均，成像時出現(xiàn)條紋。（1.49NA，100x物鏡）Scale bar: 10μm. (Stehbens, et al. 2012)

然而，在實際的顯微成像設置中，由于發(fā)射的熒光穿透轉盤的透過率很低，為了獲得較好的信噪比，曝光時間一般不會很短，所以系統(tǒng)的*終成像速度其實是受限于相機的曝光時間。對于速度較慢的CCD相機來說，主要是受限于相機自身的讀出幀速。

轉盤式共聚焦顯微鏡克服了傳統(tǒng)熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦的缺點，廣泛應用于活細胞3D成像，快速動態(tài)成像，長時間時間序列拍攝以及內(nèi)部細節(jié)結構成像等應用。然而，由于它是通過抑制光通過來提高分辨率的，搭建系統(tǒng)時，要確保相機能盡可能多地收集光子。因此，在相機選擇上，高靈敏度是首要標準。EMCCD相機曾經(jīng)是轉盤共聚焦顯微系統(tǒng)的**選擇，但現(xiàn)在，越來越多的用戶正轉向背照式sCMOS相機（如Prime 95B，Prime BSI），它們具有與EMCCD相機相當?shù)撵`敏度，但視野更大，成像速度更快。

在下一期中，我們將繼續(xù)介紹一些不同的轉盤式共聚焦顯微系統(tǒng)及其應用，請大家繼續(xù)關注我們的前沿顯微成像技術專題系列哦~

References

Graf, R, J Rietdorf, and T Zimmermann. 2005. “Live Cell Spinning Disk Microscopy.” Adv Biochem Engin/Biotechnol 95: 57-75.

Inoue, S, and T Inoue. 2002. “Direct-View High-Speed Confocal Scanner: The CSU-10.” Methods Cell Biology 70.

Jonkman, J, and C M Brown. 2015. “Any Way You Slice It - A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.” Journal of Biomolecular Techniques 26: 54-65.

Stehbens, S, H Pemble, L Murrow, and T Wittmann. 2012. “Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.” Nature Methods Enzymology 504: 293-313.